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    真菌毒素檢測技術與產品服務（1）

    發布時間： 2009/3/27　　點擊次數： 2677次
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    詳細介紹：

     液相色譜法測定谷物中赭曲霉毒素含量

     
    摘要：研究了液相色譜法測定谷物中赭曲霉毒素的方法。樣品經乙腈水（84：16）提取，提取液通過PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測器檢測，外標法定量。對添加兩個濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進行加標回收實驗，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數分別為0.281%、1.214%，zui低檢測限為0.20ng/kg，方法簡便易行，準確精密度高，值得推廣。
     
    Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in grains .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with    ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are   satisfactory.
     
    霉菌遍布世界各地，種類繁多，依生活習性，分為倉儲霉菌和田間霉菌。赭曲霉毒素（簡稱OTA）是溫暖地區zui重要的倉儲毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。在熱帶和亞熱帶地區主要由曲霉菌產生，而溫暖地區則由青霉屬產生。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長，據有關調查該毒素污染在飼料原料和配合飼料中普遍存在，陽性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大，據報道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見的臨床表現有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對家畜主要攻擊腎臟、免疫系統和造血系統，肝臟變得脆弱，劇渴，生長遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。癌癥研究機構（IARC）已證明OTA對人可能是致癌的。有建議指出OTA引起地方腎病和膀胱腫瘤。但 FAO/WHO專家協會指出，以上這些結論證據不足，其他的腎毒性可能起著重要作用（WHO2002）。一些國家已經制定*，歐盟對麥片的*是5ug/ml3.根據中國國家有關規定，玉米中赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.
    現常用的檢測方法多為薄層色譜和酶聯免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時長，而酶聯免疫法雖操作簡單，但存在假陽性，準確性欠佳，此液相色譜法操作簡便，快速，準確靈敏度高，不失為一種好方法。
    1.實驗部分：
    1.1試劑和儀器
    乙 腈（色譜純）  冰醋酸（分析純） 去離子水
    赭曲霉標準液：10ug/ml 溶劑為乙腈
    PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱
    Waters2695液相色譜儀
    熒光檢測器
    1.2步驟
    1.2.1  取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大，有地方建議取15kg。
    1.2.2  提取：取25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶內，加100ml乙腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時，用定量濾紙過濾。
    1.2.3  標準準備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個棕色瓶子里吹干，用10ml的流動相進行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標準液；另將1 ml10ug/ml
    的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內吹干，用10ml的流動相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標標準溶液。
    1.2.4   凈化濃縮：取7ml的樣品提取液進一玻璃試管內（與前處理柱配套提供）
    （加標時取7ml的空白樣品分別加10ul和35ul的1ug/ml的赭曲霉標準溶液）,加70ul的冰已酸，混合，用PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化萃取液,然后將凈化液，轉移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮氣吹干，用400ul的流動相（60/40/1水/乙腈/乙酸）溶解，渦旋30min ，轉移到1.5ml的離心管內10000rpm離心5分鐘，轉移350ul 的清潔樣品進入液相。
     
    1. 3儀器條件
     
    Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測器
    色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm   Waters PAHC18（5um）4.6*150mm
    流動相：60/40  水/乙腈
    流速：0.5ml/min  運行時間：20min
    柱溫：40℃
    進樣體積：60ul
    EX:330nm      EM:460nm
     
    2. 0測定結果
     
    2.1 標準曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標準溶液，用流動相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，制成標準曲線。
     
    表1.   標準曲線的基本參數：

    濃度范圍
    1.0
    2.0
    5.0
    10.0
    20.0
    30.0
    50.0
    峰面積
    103454.993
    210799.985
    515389.964
    1064099.926
    2285364.840
    3442139..760
    5463738.891
    相關系數
    0.9995
    回歸方程
    Y=1.11×105X-1.85×103
    檢測限
    0.20ng/kg（按3倍信噪比計算）

     
     
     
    2.2不同濃度添加回收實驗：取玉米樣品1份，分別做兩個濃度的加標回收實驗，結果見表2。
    表2.兩個濃度的樣品添加回收實驗結果表：

    組分
    本底值
    添加標準液的體積
    10ul
    35ul
    赭曲霉毒素
    0
    添加處理后理論濃度
    14.28ng/ml
    50.0ng/ml
    添加次數
    1
    2
    3
    4
    5
    1
    2
    3
    4
    5
    添加后測得濃度（ng/ml）
    14.18
    14.16
    14.13
    14.20
    14.10
    52.06
    52.16
    51.13
    51.68
    50.69
    回收率
    99.30
    99.16
    98.95
    99.44
    98.74
    104.12
    104.32
    102.26
    103.36
    101.38
    平均值
    99.12
    103.09
    RSD（%）
     
    0.281
     
    1.214

     
    2.3精密度實驗：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測定8次，結果見表3
     
    表3.精密度實驗結果

    檢測次數
    1
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    平均值
    RSD
    樣品1測定值
    11.23
    11.46
    11.41
    11.36
    11.87
    11.97
    11.67
    11.75
    11.59
    2.27
    樣品2測定值（ng/ml）
    28.57
    28.62
    28.68
    28.98
    28.87
    28.12
    28.92
    28.53
    28.66
    0.963

    3.0結論：
     
    此方法簡便易行，快速準確，靈敏度高，檢測限低，適合大批量檢測，值得推廣
     
     
    4.0參考文獻：
    王若軍,苗朝華,張振雄.中國飼料及飼料原料受霉菌毒素污染的調查報告.<<飼料工業>>2004.2（21）.:25
    （3）G.. Buttinger, E.Fuchs,H.Knapp,F.Berthiller,2004,Performance of new clean-up column for the determination of ochratoxin A in cereals and foodstuffs by HPLC-FLD.Food Additives and Contaminants,11,1107-1114.
     
     
     

     

     

     

     
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